Medium MS, stworzone przez Murashige’a i Skooga w 1962 roku, należy do bogatych podłoży. Wyróżnia się szczególnie wysoką zawartością azotu, zarówno w postaci azotanowej, jak i amonowej. Pierwotnie stworzone do hodowli tkanki łodygi tytoniu (patrz Dodatek 2), obecnie szeroko stosowane do kultur in vitro różnych gatunków roślin i ich fragmentów. Inne bogate medium to zestaw B5 Gamborga, zaprojektowane do hodowli kalusa soi, zawierające wysoki poziom azotanów i witamin z grupy B. Natomiast medium Knopa, przeznaczone dla wodnych i hydroponicznych upraw całych roślin, jest uboższe, ale czasem stosowane do kultur in vitro, zwłaszcza dla mniej wymagających gatunków, takich jak kiełkowanie nasion lub zarodników. Podobnie ubogie jest medium WH stworzone przez White’a, głównie do hodowli fragmentów korzeni. Medium WPM, stworzone przez Lloyda i McCowna dla hodowli tkanek roślin drzewiastych, charakteryzuje się niższą zawartością soli, zwłaszcza związków azotu i chloru, osiągniętą poprzez zastąpienie częściowo chlorku wapnia azotanem, a azotanu potasu – siarczanem. Ponadto, medium WPM zawiera wysoką zawartość siarki.

W pożywkach stosowanych do hodowli roślinnych kultur in vitro, głównie dodaje się witaminy z grupy B, które obejmują tiaminę (B1), kwas nikotynowy (B3, PP), kwas pantotenowy (B5) oraz pirydoksynę (B6). Do tej grupy należy także mio-inozytol, choć w przeciwieństwie do innych witamin grupy B, nie pełni on funkcji prekursora koenzymów, lecz jest istotnym składnikiem błony komórkowej. Dlatego też biochemicznie trafniej jest określać mio-inozytol jako cyklitol – cykliczny, wielowodorotlenowy alkohol.

Rzadziej używa się witaminy B2 (ryboflawiny), kwasu foliowego (witaminy Bc) oraz kwasu askorbinowego (witaminy C). Ryboflawina może przyspieszać utlenianie regulatorów wzrostu z grupy auksyn, co sprawia, że pożywki zawierające ją są nietrwałe na świetle. Dlatego często dodaje się kwas askorbinowy jako przeciwutleniacz, lub czasami aminokwas cysteinę pełniącą tę samą funkcję. Dodatkowo, do pożywek często dodaje się glicynę oraz kwas glutaminowy lub glutaminę, aby przyspieszyć wzrost niektórych obiektów.

Pożywka zazwyczaj zawiera także cukier, przy czym sacharoza w stężeniu 1-5% jest korzystna dla roślin dwuliściennych, natomiast glukoza (3-4%) lepiej sprawdza się w hodowli jednoliściennych. Innymi cukrami, które rzadziej dodaje się do pożywki są: fruktoza, maltoza, galaktoza, laktoza lub maltoza. Jednakże niektóre tkanki, jak np. tkanki sekwoi czy bielma kukurydzy, mogą korzystać z polisacharydu – skrobi jako jedynego źródła węglowodanów.

Dodawanie witamin, aminokwasów i cukrów do pożywek może wydawać się dziwne, ponieważ rośliny w warunkach naturalnych zazwyczaj korzystają z prostych związków mineralnych. Jednakże w hodowlach in vitro, gdzie rośliny nie zawsze są zdolne do fotosyntezy i nie zawsze są samożywne, dostarczanie tych organicznych substancji może przyspieszyć wzrost i częstość podziałów. Dlatego też, choć dodawanie tych składników zwiększa ryzyko zanieczyszczeń i podnosi koszty hodowli, to może być konieczne dla uzyskania pożądanych efektów.

Kluczowymi składnikami pożywek, które mają znaczący wpływ na wynik hodowli, są substancje nazywane regulatorami wzrostu lub fitohormonami. Termin „fitohormony” sugeruje, że są to substancje roślinne, które pełnią funkcje podobne do hormonów zwierzęcych. Jednak w przeciwieństwie do hormonów zwierzęcych, fitohormony często nie są wytwarzane w ściśle określonej tkance, lecz w różnych tkankach roślinnych. Mają one szeroki zakres efektów, na przykład auksyny pobudzają wydłużanie i podziały komórek, tworzenie tkanek przewodzących, korzeni przybyszowych, wzrost owoców, a także kontrolują starzenie się liści. Cytokininy natomiast pobudzają podziały komórkowe i przeciwdziałają starzeniu się organów roślinnych. Gibereliny z kolei stymulują wydłużanie się pędów, przerywanie spoczynku nasion, pąków i cebul, oraz inne procesy.

Auksyny występujące naturalnie w tkankach roślinnych (endogenne) są pochodnymi tryptofanu i zawierają dwupierścieniowy układ indolu. Ich przykładami są kwas indolilo-3-octowy (IAA) i kwas indolilo-3-masłowy (IBA). Te substancje są również łatwo dostępne w handlu i często dodaje się je do pożywek. Poza indolowymi auksynami, syntetyczne analogi mogą również wchodzić w skład pożywek, w których indol jest zastąpiony innym układem pierścieniowym. Uważa się, że aby wykazywać działanie typowe dla auksyn, substancja musi spełniać następujące warunki: a) zawierać układ pierścieniowy z co najmniej jednym wiązaniem podwójnym, b) zawierać łańcuchowy podstawnik sąsiadujący z wiązaniem podwójnym, c) zawierać grupę karboksylową oddzieloną od układu pierścieniowego jednym lub dwoma atomami węgla. Są to zapewne warunki konieczne, lecz nie wystarczające, ponieważ spełniają je również typowe aminokwasy jak tryptofan, fenyloalanina, tyrozyna, a mimo to nie wykazują aktywności auksynowej. Typowymi syntetycznymi auksynami są np. kwas α-naftylooctowy (NAA), kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy, dicamba (dikamba), picloram (pikloram). Na ogół auksyny syntetyczne mają większą trwałość i wyższą aktywność niż związki będące dokładnymi odpowiednikami auksyn endogennych. Niektóre auksyny syntetyczne (zwłaszcza 2,4-D, picloram, dicamba) bywają stosowane jako herbicydy (środki chwastobójcze; w tym celu używane są jednak w stężeniach kilkadziesiąt tysięcy razy wyższych niż w pożywkach do kultur in vitro – rzędu kilkudziesięciu gramów/l). Wśród substancji modyfikujących działanie auksyn wyróżnia się antyauksyny, tj. związki blokujące receptory auksyn, fitotropiny, tj. substancje blokujące ukierunkowany (polarny, dopodstawowy) transport auksyn, substancje przyspieszające rozpad auksyn i substancje hamujące ten proces. O tym jak różnorodne efekty morfologiczno-fizjologiczne mogą wywoływać auksyny wspominaliśmy już wyżej, szczególną uwagę warto jednak zwrócić na trzy rodzaje reakcji, uważane za najbardziej charakterystyczne dla auksyn:

pobudzanie wydłużania komórek (wzrostu wydłużeniowego)
pobudzanie podziałów komórkowych (we współdziałaniu z cytokininami, a czasami także giberelinami)
uaktywnianie niektórych jądrowych genów.

Działaniu auksyn towarzyszy też zakwaszenie środowiska (wypompowanie protonów z komórek). W niektórych przypadkach samo zakwaszenie środowiska, bez obecności auksyn wywoływało efekty typowe dla działania auksyn.

Typowymi wynikami działania cytokinin są: pobudzenie podziałów komórkowych oraz przeciwdziałanie procesowi starzenia się roślinnych organów. Cytokininy mogą także pobudzać kiełkowanie w ciemności nasion dodatnio fotoblastycznych (tj. wymagających światła do kiełkowania). W pobudzaniu podziałów komórkowych cytokininy współdziałają z auksynami. Pod niektórymi innymi względami są przeciwieństwem auksyn – powstają głównie w korzeniach (auksyny w wierzchołkach pędu), skąd wędrują ksylemem ku górze i pobudzają organogenezę pędową, pobudzają rozwój merystemów kątowych (hamowany przez auksyny), hamują wydłużanie się pędów. Również pod względem chemicznym cytokininy stanowią w pewnym stopniu przeciwieństwo auksyn – o ile, jak już wspominaliśmy, auksyny są kwasami organicznymi, to naturalne cytokininy są pochodnymi adeniny, a więc azotowej zasady. Przykładami takich naturalnie występujących w roślinach cytokinin są zeatyna i N6-izopentenyloadenina (2-iP, IPA). Pochodnymi adeniny, ale mającymi charakter wyłącznie cytokinin egzogennych (sztucznie wprowadzanych) są 6 benzyloaminopuryna (BAP) i kinetyna. Istnieje też grupa substancji o zupełnie innej budowie chemicznej (pochodnych mocznika), ale bardzo podobnym działaniu fizjologicznym, stąd nazywa się je związkami cytokininopodobnymi, albo po prostu mocznikowymi cytokininami. Ich przykładami są tidiazuron (thidiazurone = TDZ) i CPPU.

Wszystkie gibereliny natomiast zawierają złożony, czteropierścieniowy szkielet gibanu. Opisano dotychczas grubo ponad 100 związków tego typu, obejmujących kwas giberelinowy i jego różne pochodne. W praktyce tylko kilka substancji z tej grupy bywa czasami dodawane do pożywek, a najczęściej jest to kwas giberelinowy (GA3). Typowe wyniki działania giberelin to pobudzenie wydłużania pędów (zwłaszcza u karłowatych mutantów), zahamowanie wzrostu korzeni bocznych, przerwanie spoczynku nasion, pąków i cebul, uaktywnienie enzymów katabolicznych w nasionach, pobudzenie kiełkowania pyłku i wydłużania łagiewek pyłkowych, wywoływanie partenokarpii (powstawania owoców z niezapylonych słupków), pobudzenie kwitnienia w warunkach nieindukcyjnych. Czasami stosuje się też substancje hamujące biosyntezę giberelin, np. paclobutrazol, ancymidol, które powstrzymując wzrost bulw, cebul, czy zarodków, pozwalają na zgromadzenie w nich większej ilości materiałów zapasowych, a także ułatwiają aklimatyzację roślin do niesprzyjających warunków hodowli ex vitro.

Warto podkreślić, że wynik działania fitohormonów w pożywce zależy od stanu fizjologicznego umieszczonej na niej tkanki i od występujących w komórkach fitohormonów endogennych. Regulatory wzrostu pobierane są z pożywki, co prowadzi do przejściowego podwyższenia wewnątrzkomórkowego stężenia tych substancji. Ten wzrost jest zwykle krótkotrwały, ponieważ istnieją naturalne mechanizmy unieczynniania fitohormonów, częściowo w wyniku rozpadu (np. wspomnianego już utleniania indolowych auksyn), częściowo zaś w wyniku wbudowywania ich w konjugaty – mało aktywne fizjologicznie połączenia z innymi substancjami, np. cukrami. Ocenia się, że zaledwie ok. 1% głównych fitohormonów występuje w komórce w postaci wolnej, większa ich część natomiast tworzy konjugaty.

Wszystkie wymienione dotąd składniki pożywek są substancjami o ściśle określonym składzie. Pożywki, które zawierają tylko takie substancje, nazywa się syntetycznymi. Czasami wzbogaca się jednak pożywki niejednorodnymi substancjami, które mają bardzo złożony skład chemiczny, nie w pełni znany badaczowi i w niewielkim stopniu przez niego kontrolowany. Dodatkami takimi mogą być: hydrolizat kazeiny, peptony, ekstrakt drożdżowy, mleczko kokosowe, a sporadycznie mleczko kukurydziane, sok pomidorowy itp. Te mieszaniny są zwykle źródłem aminokwasów, witamin lub fitohormonów, i gdy tylko to możliwe, badacze dążą do zastępowania ich związkami chemicznymi w ściśle określonej postaci i ilości. Hydrolizat kazeiny i ekstrakt drożdżowy mogą pobudzać wzrost eksplantatów, ale bardzo ułatwiają też rozwój drobnoustrojów, stąd czasami dodawane są do pożywki po prostu dla sprawdzenia skuteczności odkażania materiału roślinnego użytego do zapoczątkowania hodowli. Hydrolizat kazeiny wzmacnia działanie cytokinin, zwłaszcza w obecności IAA.

Czynnikiem stosowanym do utrwalania jest najczęściej agar, choć rzadziej używa się agarozy, κ-karagenu (kappa-karagenu; ang. κ-karrageenan) itp. Agar to substancja polisacharydowa, która występuje w ścianach komórkowych morskich krasnorostów (Gelidium sp. i Gracilaria sp.). Składa się ona głównie z dwóch części: niepolarnego polimeru, znanego jako agaroza, oraz zmiennej ilości polarnych podstawników. Można używać standardowego agaru mikrobiologicznego, jednak dostępne są także agary dedykowane specjalnie do kultur roślinnych. W takich przypadkach producent zapewnia, że produkt nie zawiera żadnych zanieczyszczeń, które mogłyby hamować wzrost roślin. Agary różnią się między sobą stopniem czystości oraz zdolnością do żelowania (wytrzymałością mechaniczną galaretki uzyskanej z agaru o określonym stężeniu). W niektórych wrażliwych hodowlach (np. komórek glonu zawłotni) zaleca się przemywanie agarów przed dodaniem ich do pożywki, jednak takie środki ostrożności są stosowane rzadko.

Czynniki żelujące są zazwyczaj wybierane jako substancje, które rośliny nie mogą przyswoić, co oznacza, że pełnią głównie funkcje mechaniczne i regulujące osmotyczność, ale nie mają bezpośredniego wpływu na metabolizm komórek roślinnych. Niemniej jednak stężenie substancji żelującej w pożywce może istotnie wpływać na wyniki hodowli. Na przykład w hodowlach cienkich kawałków łodygi tytoniu prowadzonych na pożywce z 1% agaru, otrzymuje się zawiązki kwiatów, podczas gdy przy niższych stężeniach agaru tworzą się pąki wegetatywne. Czasami w kulturach in vitro można zauważyć zaburzenia związane z gospodarką wodną tkanek i dostępnością wody w pożywce. Charakterystycznym objawem tych zaburzeń jest nadmierne uwodnienie tkanek, co prowadzi do przejrzystego, szklistego wyglądu (te zaburzenia są nazywane szklistością lub witryfikacją). Prawdopodobnie wynikiem niewłaściwej gospodarki wodnej roślin jest czasami obserwowane zamieranie wierzchołków pędów. Aby rozwiązać te problemy, można zmienić stężenie lub rodzaj czynnika żelującego oraz zapewnić lepszą wymianę gazową roślinom (na przykład poprzez zastosowanie odpowiednich pokryw naczyń hodowlanych).

Gdy nie dodaje się żadnego czynnika żelującego do pożywki, a hodowane rośliny są zanurzone w płynnej pożywce, niezbędne jest regularne napowietrzanie hodowli, w przeciwnym razie komórki roślinne mogą ulec zatruciu przez produkty fermentacji. Zazwyczaj hodowle na płynnych pożywkach przeprowadza się w kolbach stożkowych, a napowietrzanie pożywki osiąga się poprzez szybkie wstrząsanie kolb na specjalnych wstrząsarkach. Jeśli eksplantat użyty do takiej hodowli składa się z luźnego skupiska komórek, na przykład kalusa, wstrząsanie kultury może spowodować rozpad kalusa na pojedyncze komórki i małe skupiska komórek. W ten sposób tworzą się tzw. hodowle zawiesinowe.

Dobór odpowiedniej pożywki to w dużej mierze proces oparty na eksperymentach i praktycznym doświadczeniu. Ze względu na bogactwo składników oraz ich różnorodne kombinacje stężeń, badacze często koncentrują się na optymalizacji kilku kluczowych składników, pozostawiając pozostałe na stałym, standardowym poziomie. Ponieważ główną rolę w kierowaniu procesami wzrostu w hodowlach in vitro odgrywają fitohormony oraz, w mniejszym stopniu, witaminy, to na ich optymalizacji skupia się najwięcej uwagi. Natomiast dobór soli mineralnych często ogranicza się do porównania kilku standardowych zestawów, takich jak składniki mineralne MS i B5. Poprzez analizę działania różnych stężeń wybranych fitohormonów i takiej samej liczby stężeń cytokininy można wstępnie ustalić optymalną kombinację fitohormonów. Po znalezieniu zadowalającej mieszanki fitohormonów, warto sprawdzić, czy pożywka ma odpowiedni potencjał osmotyczny. W tym celu porównuje się hodowle na pożywkach zawierających zoptymalizowany zestaw fitohormonów i, w razie potrzeby, witamin, przy standardowym stężeniu soli mineralnych lub ich rozcieńczeniu 2 do 4-krotnym. Dodatkowo, zaleca się porównanie wpływu różnych stężeń sacharozy oraz innych cukrów na wyniki hodowli.