W celu efektywnego, masowego rozmnażania roślin metodą in vitro, stosuje się pięciostopniowy schemat mikrorozmnażania zaproponowany przez Debergha i Maene w 1981 roku. Procedura ta została szeroko zaadaptowana w biotechnologii roślinnej i umożliwia produkcję dużej liczby jednorodnych roślin w kontrolowanych warunkach. Każdy etap tego procesu pełni odrębną funkcję biologiczną i technologiczną:

Stage 0 – Prekultury (stadium przygotowawcze)
Etap ten polega na przygotowaniu rośliny matecznej do pobrania eksplantatów. Kluczowe jest tutaj zapewnienie optymalnych warunków wzrostu i zdrowotności materiału wyjściowego (np. warunki szklarniowe, nawożenie, eliminacja patogenów). Celem tego stadium jest uzyskanie eksplantatów o wysokim potencjale regeneracyjnym i niskim poziomie kontaminacji mikrobiologicznej. W niektórych przypadkach prowadzi się wstępne traktowanie roślin np. fitohormonami lub fungicydami.

Stage 1 – Inicjacja i stabilizacja kultury aseptycznej
Eksplantaty (np. merystemy wierzchołkowe, fragmenty pędów lub liści) są pobierane i sterylizowane chemicznie (np. roztworem podchlorynu sodu, etanolu) w warunkach aseptycznych. Następnie umieszcza się je na odpowiednio dobranej pożywce zawierającej makro- i mikroelementy, witaminy, cukry oraz regulary wzrostu (auksyny, cytokininy). Celem tego etapu jest indukcja początkowego wzrostu i stabilizacja metaboliczna kultury – uzyskanie aktywnego wzrostu bez oznak nekrozy, kontaminacji czy nadmiernej reaktywności tkanek.

Stage 2 – Namnażanie (rozmnażanie klonalne)
W tym stadium dochodzi do właściwego mikrorozmnażania. Z wykorzystaniem wcześniej ustabilizowanych eksplantatów prowokuje się intensywny rozwój nowych pędów bocznych lub zarodków somatycznych. Pędy te są następnie dzielone (subkulturowane) i przenoszone na nowe pożywki, co pozwala na szybkie zwiększanie liczby roślin potomnych. Kluczowe w tym etapie jest utrzymanie równowagi hormonalnej – zwykle stosuje się pożywki o podwyższonej zawartości cytokininy i niskiej zawartości auksyny. Efektywność namnażania zależy m.in. od gatunku rośliny, rodzaju eksplantatu, warunków świetlnych i termicznych.

Stage 3 – Przygotowanie do warunków in vivo (ukorzenianie)
Nowo powstałe pędy są przenoszone na pożywkę ukorzeniającą, zawierającą zwykle wyższe stężenia auksyn (np. IAA, IBA lub NAA), które indukują rozwój systemu korzeniowego. Celem tego stadium jest uzyskanie kompletnej sadzonki (pęd + korzeń) zdolnej do dalszego wzrostu poza warunkami in vitro. Ukorzenianie może być trudne u niektórych gatunków – w takich przypadkach stosuje się dodatkowe czynniki, takie jak zmniejszenie stężenia soli mineralnych, ograniczenie światła lub zastosowanie żelu agarowego o zmodyfikowanej strukturze.

Stage 4 – Przeniesienie do warunków in vivo i aklimatyzacja
To najtrudniejszy i najbardziej krytyczny etap całego procesu. Młode rośliny, przyzwyczajone do warunków sterylnych, wysokiej wilgotności i ograniczonego światła, muszą być stopniowo adaptowane do środowiska zewnętrznego. Aklimatyzacja odbywa się najpierw w warunkach szklarniowych (np. w miniszklarenkach lub tunelach foliowych), gdzie sukcesywnie obniża się wilgotność i zwiększa intensywność światła. Dopiero po udanej adaptacji możliwe jest posadzenie roślin do gleby lub substratu produkcyjnego. Sukces tego etapu zależy m.in. od jakości systemu korzeniowego, tempa transpiracji i zdolności fotosyntetycznych młodych roślin.

Rodzaje rozmnażania roślin in vitro:

W praktyce laboratoryjnej stosuje się kilka podstawowych strategii rozmnażania roślin in vitro. Różnią się one źródłem materiału wyjściowego i stopniem złożoności procesu:

Organogeneza – polega na tworzeniu całych organów (pędów, korzeni) z wybranych tkanek roślinnych. Może być:

– bezpośrednia – organy powstają bezpośrednio z eksplantatu (fragmentu rośliny),

– pośrednia – powstają najpierw kalusy (tkanka przyranna), z których następnie rozwijają się organy.

Somatyczna embriogeneza – to proces, w którym z komórek somatycznych (czyli nierozrodczych) rozwijają się struktury przypominające zarodki roślinne, zdolne do dalszego rozwoju w pełnoprawne rośliny. Proces ten jest szczególnie użyteczny w przypadku rozmnażania roślin trudnych w klasycznej uprawie.